微球三维位置的精确测量是单分子力谱测量技术中的关键。采用同轴数字全息技术对微球的三维位置进行测量。通过同轴数字全息显微系统采集一系列微球的全息图像，利用瑞利-索末菲传播原理对全息图进行三维重构，同时对重构光场进行去卷积运算，消除了散斑、离焦信号等噪音，并对微球球心纵向光场分布进行多项式拟合，提高了微球三维位置测量精度。实验表明，该方法不仅能够对全视场中的微球进行并行测量，而且能够对交叠微球进行测量，纵向分辨力达到2 nm，在生物单分子动力学、粒子图像测速技术等研究领域具有重要意义。