红外显微成像技术将红外光谱技术和显微技术相结合，不仅可以提供测试样品的光谱信息而且能够提供测试样品的空间分布信息。然而复杂样品的红外显微图像谱峰重叠严重，无法直接获得目标组分的分布信息。将因子分析与光谱分离技术相结合提出了主成分分析－二阶导数光谱成像方法。通过兔子动脉红外显微图像中胆固醇分布的成像实验，验证该方法的可行性和有效性。实验结果表明，该方法可以提高光谱分辨率，挖掘隐藏于重叠谱峰中的有用信息，是一种有效的红外显微图像分析方法。