多光谱活体荧光成像技术正逐渐成为生物医学研究的关键技术，但是荧光物质光谱之间的串扰和自发荧光现象严重影响了荧光影像的解译。混合光谱分解对于去除活体多光谱荧光影像自发荧光效应和进行多种荧光信号分离是非常有效的技术，但是光谱分解的前提是获得了各种荧光物质的光谱。基于多元曲线解析交替最小二乘法（MCR-ALS）计算框架，提出包括非负、等式、闭合性、单峰、波段范围及归一化的多约束条件的荧光纯光谱估计方法，利用估计的纯光谱和线性混合光谱模型得到不同荧光信号的分离，去除自发荧光背景对起标记目的的荧光物质信号