光斑中心定位是光学测量中的关键技术之一，针对小尺寸光斑中心定位算法精度低等问题，提出了一种具有高精度的小尺寸光斑中心两步定位算法。通过寻找一阶导数零交叉点的方法确定光斑中心所在的像素级坐标，然后利用该中心邻域内不饱和点的灰度信息进行高斯拟合计算光斑中心亚像素级坐标。实验结果表明：在无噪声污染光斑图像中，与其他经典算法相比，两步定位算法误差远小于 0.05 像素，保证了光斑中心的高精度定位，且光斑成像越接近理想高斯分布，精度越高。